MTD 243-670 Manual do Utilizador Página 1

Bindung des C1-Carriers Tetrahydromethanopterin und seiner Derivate an Enzyme des Energiestoffwechselweges methanbildender Archaeen Dissertation

INHALT Abkürzungen VIAbbildungen VIIIGleichungen IXTabellen X 1 Einleitung 1.1 Methanogene Archaeen 11.2 Der C1-Carrier Tetrahydromethanopterin (H

4 Ergebnisse Wie erwartet liegen die sp3-konfigurierten Atome C6, C7 und C9 des Tetrahydropyrazin- und des Imidazolindinrings sowie die Methylgruppen,

4 Ergebnisse 84Abbildung 4.18: Wasserstoffbrückenbindungen (blau) und van-der-Waals-Kontakte (grün) zwischen Aminosäureresten in der Bindetasche von

4 Ergebnisse Abbildung 4.19: Die aromatischen Ringe von Methylen-H4MPT befindet sich annähernd in einer Ebene. Die an Atom C7 gebundene Methylgruppe (

4 Ergebnisse sich an der Spitze eines ungewöhnlichen Loops nach Faltblattstrang β3. Dieser Strang bildet zusammen mit Strang β1 den Schaltpunkt des β-

4 Ergebnisse a) b) Abbildung 4.21: a) Der Deazaisoalloxazinring von F420 (grün) und das Benzyl-Imidazolidin-Pyrazin-Ringsystem von Methylen-H4MPT (gr

5 Diskussion 5 Diskussion 5.4 Der N5-Methyl-H4MPT:Coenzym M-Methyltransferasekomplex aus M. marburgensis 5.1.1 Isolierung und Reinigung des Mtr-K

5 Diskussion des Zellaufschlusses schien einen gewissen Einfluss zu haben. Wann genau es hauptsächlich zu einem Verlust der Untereinheit MtrH kam, kon

5 Diskussion berechnetes Molekulargewicht von 336 kDa, welches mit dem in der Gelfiltration auftretenden Schulterpeak und dem Ergebnis der BN-Page in

5 Diskussion des Proteins. Dies bestätigte den Befund, der schon während der Membranpräparation und Reinigung gemacht worden waren, dass nämlich der G

5 Diskussion in den bisher erfolgten elektronenmikroskopischen Aufnahmen mit Negativfärbung weniger heterogen erschien. Es besteht also die berechtigt

3.3 Kultivierung von Bakterien 323.3.1 Bestimmung der Zelldichte 323.3.2 Kultivierung für die Plasmidpräparation 323.3.3 Kultivierung für die Pro

5 Diskussion 5.2.2 Des-[225-246]-MtrA (MJMtrA3) aus M. jannaschii In dieser Arbeit konnte erstmalig um 22 C-terminale Aminosäuren verkürztes MtrA au

5 Diskussion Konfiguration gebunden wird (55, 143). Anders als andere Cob(I)amid- und Cob(II)amid in base-off/His-on-Konfiguration bindende Enzyme, de

5 Diskussion berechnete Wert auf 27 kDa belief. Gründe hierfür könnten eine erhöhte elektrophoretische Mobilität des korrekt gefalteten Apoproteins se

5 Diskussion MJMtrH besitzt deswegen 14 zusätzliche N-terminale Aminosäuren, welche vermutlich die Faltung des Proteins in E. coli weiter erschwerten.

5 Diskussion vom Gesamtkomplex wurde auch in dieser Arbeit beobachtet, allerdings war eine chromatographische Abtrennung nicht vollständig möglich. Um

5 Diskussion von 2,0 Å zeigten keine wesentlichen Unterschiede in der Substratbindung und -konformation. Es ist davon auszugehen, dass es sich bei dem

5 Diskussion genannte Anordnung könnte sein, dass diese den Van-der-Waals-Kontakt des äußerst sperrigen H4MPT-Moleküls zum C5-Atom von F420 vereinfach

5 Diskussion sodass die meisten der Ringatome in Van-der-Waals-Kontakt zueinander stehen. Die mit 3,43 Å kürzeste Distanz befindet sich zwischen den a

5 Diskussion 5.5 Ausblick Mit der in dieser Arbeit entwickelten Methode zur Reinigung des N5-Methyl-H4MPT:Coenzym M-Methyltransferasekomplexes ohne U

5 Diskussion Zur heterologen Expression der Untereinheit MtrH wurden neben den Versuchen in dieser Arbeit bereits zahlreiche Varianten getestet. Eine

4.4 Rekombinantes des-[225-246]-MtrA (MJMtrA3) aus M. jannaschii 694.4.1 Reinigung 694.4.2 Charakterisierung 704.4.3 Kristallisation 714.5 Rekomb

6 Literatur 6 Literatur 1. Woese, C. R., Kandler, O., and Wheelis, M. L. (1990) Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Arch

6 Literatur 15. Breitung, J., and Thauer, R. K. (1990) Formylmethanofuran: tetrahydromethanopterin formyltransferase from Methanosarcina barkeri. Ide

6 Literatur 30. Thauer, R. K., and Kunow, J. (1995) in Sulfate Reducing Bacteria (Barton, L. L., Ed.), pp 33-48, Plenum Press, New York. 31. Chistos

6 Literatur 44. Ermler, U., Hagemeier, C. H., Roth, A., Demmer, U., Grabarse, W., Warkentin, E., and Vorholt, J. A. (2002) Structure of methylene-tet

6 Literatur 58. Weiss, D. S., Gärtner, P., and Thauer, R. K. (1994) The energetics and sodium-ion dependence of N5-methyltetrahydromethanopterin:coen

6 Literatur 72. Mukhopadhyay, B., and Daniels, L. (1989) Aerobic purification of N5,N10-methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase, separated fro

6 Literatur 85. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaeffer, A. A., Zhang, J. H., Zhang, Z., Miller, W., and Lipman, D. J. (1997) Gapped BLAST and PSI-

6 Literatur 105. Slesarev, A. I., Mezhevaya, K. V., Makarova, K. S., Polushin, N. N., Shcherbinina, O. V., Shakhova, V. V., Belova, G. I., Aravind, L

6 Literatur 123. Klein, A. R., and Thauer, R. K. (1997) Overexpression of the coenzyme F420-dependent N5,N10-methylenetetrahydromethanopterin dehydr

6 Literatur 143. Harms, U., and Thauer, R. K. (1996) The corrinoid-containing 23-kDa subunit MtrA of the energy-conserving N5-methyltetrahydromethano

ABKÜRZUNGEN Aλ Absorbanz bei Wellenlänge λ Amp Ampicillin AS Aminosäure(rest) AU absorption units (Absorptionseinheiten) bp base pairs (Basenpaare)

7 Anhang 7 Anhang 7.1 Eichgeraden der Gelfiltrationssäulen 7.1.1 Eichgerade Superdex 200 16/60 prep grade y = -0,0812x + 17,37499,51010,51111,51212

7 Anhang 7.1.3 Superose 6 PC 3.2/30 y = -3,5248x + 11,234,54,74,95,15,35,55,75,96,16,36,56,71,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8Elutionsvolumen [mL]ln MW [in kDa]

7 Anhang 7.2 Vektorkarten 115

7 Anhang 116

7 Anhang 7 Anhang 117 117

7 Anhang 118

7 Anhang 7.3 Primer-Sequenzen für die Polymerasekettenreaktion Tabelle 7.1: Primer für die Amplifikation mittels PCR (siehe Abschnitt 3.2.2)

7 Anhang 7.4 Gensequenzen Sequenzierung 1 : MJmtrH/pCRblunt 1.1 Primer M13 Forward (-20) 1 TTTTGATGTA TACGACTCAC TATAGGGCGA ATTGGGCCCT CTAGATGCAT

7 Anhang 2.2 Primer T7-Terminator 1 TTGAACATAG CTCTTTCGGG CTTTGTTAGC AGCCGGATCT CAGTGGTGGT GGTGGTGGTG CTCGAGTGCG GCCGCAAGCT 81 TGTCGACGGA GCTCGA

7 Anhang Sequenzierung 4 : MJmtrA2/pCRblunt 4.1 Primer M13 Forward (-20) 1 GGGGATTACG ACGGCAGTGA TTGTAATACG ACTCACTATA GGGCGAATTG GGCCCTCTAG ATGCA

UV Ultraviolettes Licht (λ < 400 nm) v/v Volumen pro Volumen w/v weight per volume (Gewicht pro Volumen) ε Extinktionskoeffizient SI-Einheiten

7 Anhang 5.2 Primer M13 Reverse 1 CCGCATGACT GATTACGCCA GCTATTTAGG TGACGCGTTA GAATACTCAA GCTATGCATC AAGCTTGGTA CCGAGCTCGG 81 ATCCACTAGT AACGGCCG

7 Anhang Sequenzierung 7 : MJmtrA3/pACYC-Duet1 7.1 Primer Duet UP2 1 ATTGTGAGCG GATAACAATT CCCCATCTTA GTATATTAGT TAAGTATAAG AAGGAGATAT ACATATGGTG A

7 Anhang 7.5 Daten ESI-MS-Analyse von MJMtrA3 125

DANKSAGUNG Bei PD Dr. Ulrich Ermler möchte ich mich von Herzen für die exzellente fachliche Anleitung, die fürsorgliche und wohlwollende Betreuung wä

PERSÖNLICHE ANGABEN Katharina Elisabeth Ceh geb. Körner Geburtstag und -ort 28.06.1977 in Stuttgart Familienstand verheiratet Nationalität deut

ABBILDUNGEN 1.1: Der CO2-reduzierende methanogene Stoffwechselweg in Methanobakterien, Methanococci und Methanopyrales und seine energiekonservieren

4.11: Coomassie-gefärbte SDS-Page und Aminosäuresequenz von M. jannaschii MtrA. Seite 71 4.12: Western Blot mit Anti-StrepII-Antikörpern von Proben

TABELLEN 2.1: In dieser Arbeit verwendete Computerprogramme. Seite 14 2.2: Parameter der verwendeten Chromatographiesäulen. Seite 17 2.3: In dieser A

1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Methanogene Archaeen Archaeen bilden neben Bakterien und Eukaryoten die dritte Domäne des Lebens und werden weiter in

1 Einleitung Methenyl-H4MPT-Cyclohydrolase (Mch) in N5,N10-Methenyl-H4MPT umgewandelt, welches als nächstes zu N5,N10-Methylen-H4MPT reduziert wird (1

vom Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie der Johann Wolfgang Goethe-Universität als Dissertation angenommen. Dekan: Prof. Dr.

1 Einleitung Abbildung 1.1: Der CO2-reduzierende methanogene Stoffwechselweg in Methanobakterien, Methanococci und Methanopyrales und seine energieko

1 Einleitung 1.2 Der C1-Carrier Tetrahydromethanopterin (H4MPT) Die Umwandlung von C1-Einheiten zu Fumarat, Formaldehyd oder Methanol verläuft in me

1 Einleitung Abbildung 1.2: Tetrahydromethanopterin (H4MPT) und sein Strukturanalogon Tetrahydrofolat (H4F). anaerober Bakterien, bei welchen der Na+-

1 Einleitung CH3-H4MPT + E:Co(I) ' H4MPT + E:CH3-Co(III) Gleichung 1.1 E:CH3-Co(III) + HSCoM ' E:Co(I) +

1 Einleitung Abbildung 1.4: Cofaktor 5’-Hydroxybenzimidazolylcobamid (Vitamin B12a) der N5-Methyl-H4MPT:Coenzyme M-Methyltransferase (Mtr). Als axial

1 Einleitung MtrH enthält keinen Membranteil und vermittelt wahrscheinlich den Methylgruppentransfer zum Cob(I)amid (65). Aufgrund dieser Annahme ist

1 Einleitung 1.4 Die F420-abhängige N5,N10-Methylen-H4MPT-Dehydrogenase (Mtd) Der reversible Schritt der Reduktion von Methenyl-H4MPT+ oder Methenyl-

1 Einleitung Abbildung 1.6: Die von der F420-abhängigen N5,N10-Methylen-H4MPT-Dehydrogenase (Mtd) katalysierte, stereogene Reaktion. F420 ist ein gr

1 Einleitung gewundenen, sechssträngigen parallelen β-Faltblatt (β1-β6) zusammen, welches von drei α-Helices (α2-α4) auf der Vorder- und zwei α-Helic

1 Einleitung der sechs Monomere in Form eines Bündels aus zwölf Helices um eine dreifache Achse anordnen (siehe Abbildung 1.8 und 1.9). Abbildung 1.8:

EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig angefertigt und keine weiteren Hilfsmittel und Quell

1 Einleitung 1.5 Ziel der Arbeit Ziel dieser Arbeit war die strukturelle Charakterisierung der Bindung von H4MPT-Derivaten an zwei Enzyme des methan

2 Material 2 Material 2.1 Computerprogramme Tabelle 2.1: In dieser Arbeit verwendete Computerprogramme. Programm Anwendung Hersteller/Referenz bla

2 Material 2.2 Geräte und Chemikalien 2.2.4 Allgemeine Geräte Analysenwaage R180D-*D1 Sartorius, GöttingenEismaschine Ziegra, IsernhagenGefriersch

2 Material 2.2.6 Bakterienkultivierung Brutschrank (37ºC) BK-600 Heraeus, HanauDampfsterilisator V-150 Holzner, NusslochSystech, Lauf/a. d. Pegnitz

2 Material 2.2.10 Säulen/-materialien Gepackte Säulen HiTrap™ Ion Exchange Selection Kit HiTrap™ DEAE FF HiTrap™ Q HP HiLoad™ 26/10 Q-Sepharose HP S

2 Material 2.2.11 Elektroblotten Blotapparatur Eigenbau MPI für Biophysik, FrankfurtSpannungsquelle PowerPac™ BASIC PowerPac™ HC BioRad, München 2

2 Material 2.2.15 Chemikalien Gängige Laborchemikalien sind nicht aufgeführt. Soweit nicht anders beschrieben, wurden alle Chemikalien mit Reinheitsg

2 Material SDS (Natriumdodecylsulfat) Gerbu, GaibergTEMED (N,N,N',N'-Tetramethyl-p-ethylendiamid) Amersham Biosciences, FreiburgTricin Ger

2 Material 2.2.17 Kits HiSpeed® Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden ProteoExtract® All-in-One Trypsin Digestion Kit Calbiochem, Darmstadt QIAquick® Gel

2 Material 2.4 Mikroorganismen und Medien 2.4.4 Archaeen-Stämme Stamm Beschreibung Quelle/Referenz Methanothermobacter marburgensis (DSM 2133) (Meth

Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden von September 2005 bis Februar 2009 unter Anleitung von PD Dr. Ulrich Ermler am Max-Planck-Institut

2 Material Stamm Beschreibung Genotyp Resistenz Quelle/ Referenz BL21(DE3) Starke Überexpression mit T7 Promotor F-, dcm, ompT, hsdSB(rB-mB+), gal,

3 Methoden 3 Methoden 3.1 Planung der Vektorkonstrukte Das Vektorkonstrukt MMRmtrH/pET22b+ zur rekombinanten Expression der Mtr-Untereinheit MtrH a

3 Methoden verwendeten Plasmide wurden nach Absprache von Herrn PD Dr. Thorsten Selmer (Fachbereich Biologie, Philipps-Universität Marburg) angefertig

3 Methoden 3.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.1 Extraktion und Reinigung genomischer DNA aus Archaeen-Zellen Zur Extraktion der genomischen DNA

3 Methoden Klon Templat Vorwärts-Primer (Schnittstelle) Rückwärts-Primer (Schnittstelle) Zielvektoren MJmtrH genom. DNA M. jannaschii MJmtrH+ (NdeI

3 Methoden 3.2.3 Restriktionsspaltung, Dephosophorylierung und Ligation von DNA Zum analytischen Restriktionsverdau wurde folgende Reaktionsmischung

3 Methoden Tabelle 3.5: Übersicht über die Plasmidherstellung. Ausgangsvektor Restriktions-spaltung Eingesetzter Vektor Restriktions-spaltung Zielve

3 Methoden 3.2.5 Plasmidpräparation Plasmidpräparationen für analytische Zwecke wurden aus 5 mL LB-Kultur mit dem QIAprep® Spin Miniprep Kit (Qiagen

3 Methoden Proteine hingegen zeigen ein Absorptionsmaximum bei 280 nm, sodass das Verhältnis A260/A280 zur Überprüfung der Probe auf Kontaminationen g

3 Methoden 3.3 Kultivierung von Bakterien 3.3.1 Bestimmung der Zelldichte Zur Bestimmung der Zelldichte wurde die optische Dichte bei 600 nm (OD60

VERÖFFENTLICHUNGEN Ceh, K., Demmer, U., Warkentin, E., Moll, J., Thauer, R. K., Shima, S. and Ermler, U.(2009) Structural basis of the hydride transfe

3 Methoden Tabelle 3.7: Übersicht über die zur Proteinexpression verwendeten Plasmide und E. coli-Stämme. Protein(e) Beschreibung Plasmid(e) E. c

3 Methoden Coexpression von des-[225-246]-MtrA und MtrH (MJMtrA3+MJMtrH) aus M. jannaschii: Die Coexpression von des-[225-246]-MtrA und MtrH (MJMtrA3+

3 Methoden Benzonase® Nuclease (Novagen, Darmstadt) und 5 µg Lysozym versetzt und 30 min bei RT inkubiert. Bei den vor der Induktion genommenen Proben

3 Methoden Standard zum Größenvergleich wurden 8 µL Prestained Protein Marker, Broad Range (6–175 kDa) (New England Biolabs, Frankfurt) aufgetragen.

3 Methoden 3.4.4 Elektrophoretischer Proteintransfer und direkter ELISA (Western Blot) Um die durch SDS-Page aufgetrennten Proteine aus der Polyacry

3 Methoden Hierbei wurde eine minimale Proteinprobe (ca. 100 µg, maximal 50 µL) auf einer geeigneten Gelfiltrationssäule (Superdex 200 PC 3.2/30 oder

3 Methoden Matrix-unterstützte Laserdesorptions/Ionisations-Massenspektrometrie mit Flugzeitmassen-Analyse (MALDI-TOF): Bei dieser Methode werden die

3 Methoden resuspendiert, mit einem Dispergiergerät homogenisiert und erneut zentrifugiert (100 000 x g, 1 h, 4˚C). Beim zweiten Waschschritt wurde in

3 Methoden Superose 6 Gelfiltration: ↓ Q-Sepharose Ionenaustauschchromatographie: ↓ DEAE-Sepharose Ionenaustauschchromatographie: ↓ Solubilisierte Mem

3 Methoden Ionenaustauschchromatographie mit Q-Sepharose: Die vereinigten Fraktionen des vorherigen Abschnitts wurden mit der doppelten Menge Puffer A

SUMMARY The aim of this thesis was a structural characterization of the binding of tetrahydromethanopterin derivatives to enzymes of the energy conse

3 Methoden 280 nm als proteinhaltig identifizierten Fraktionen wurden vereinigt und mit einem Konzentrator mit einem MWCO von 10 kDa auf ca. 250 µL ei

3 Methoden Nach Zugabe von Vitamin B12a bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM wurde zur Entfernung von ungebundenem Vitamin B12a gegen 1 L Gelfiltr

3 Methoden Die rückgefaltete Proteine wurden wiederum einer Gelfiltration auf Superdex 200 (Superdex 200 PC 3.2/30, CV: 2,6 mL) bei 4 °C und Flussrate

3 Methoden entstand aus der spontanen Reaktion von H4MPT mit Formaldehyd und anschließender Lyophilisierung. Chemisch synthetisiertes F0 wurde von Her

3 Methoden Deckplättchen und Silikonfett abgedichtet wurden, verwendet. Das Volumen der Reservoirlösung betrug hier 0,5-1 mL, der Tropfen bestand aus

3 Methoden rZMMznVV⋅⋅= Gleichung 3.2 MSolvVV23,11−= Gleichung 3.3VM: Matthews-Koeffizient Vz: Volumen der Elementarzelle n: Anzahl der Moleküle pro

3 Methoden beobachteten Strukturfaktoren aus den Messdaten Fobs ermöglichen die Erstellung von Elektronendichtekarten. 3.6.4 Modellbau und Verfeiner

3 Methoden ∑∑∈∈⋅−=ThklobsThklcalcobsfreehklFhklFkhklFR)()()( Gleichung 3.6│Fobs(hkl)│: Strukturfaktoramplitude aus den Messdaten │Fcalc(hkl)│: Berec

3 Methoden Zur Vorbereitung für die Messung unter Cryo-Bedingungen wurden 3 µL der Probe (MtrA-H; 0,8 mg/mL in 20 mM MOPS/KOH pH 7,0, 10 mM MgCl2, 0,0

4 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Planung und Herstellung der Vektorkonstrukte 4.1.1 Sekundärstrukturanalyse zur Planung der Konstrukte MJmtrA1, MJmtrA

MtrA from M. jannaschii without its transmembrane helix could be produced in E. coli as a soluble protein. The holoprotein could be purified to homoge

4 Ergebnisse Abbildung 4.1: Sequenzvergleich der Untereinheit MtrH der N5-Methyl-H4MPT:Coenzym M-Methyltransferase (MtrH) aus M. marburgensis (MMR),

4 Ergebnisse 4.2 Der N5-Methyl-H4MPT:Coenzym M Methyltransferasekomplex aus M. marburgensis 4.1.4 Isolierung und Reinigung Membranpräparation und

4 Ergebnisse Ionenaustauschchromatographie mit DEAE-Sepharose: Für den ersten chromatographischen Reinigungsschritt wurde das Membransolubilisat (sieh

4 Ergebnisse 56DEAE Sepharose MtrA-H020040060080010001200140016001800138 188 238 288Elutionsvolumen/[mL]Absorption 280nm/[mAU]020406080100Puffer B.1/

4 Ergebnisse Ionenaustauschchromatographie mit Q-Sepharose: Die vereinigten Fraktionen des vorherigen Abschnitts wurden einer weiteren Chromatographie

4 Ergebnisse Präparative Gelfiltration: Als letzter Reinigungsschritt wurde mit den jeweils vereinigten Fraktionen der Ionenaustauschchromatographie a

4 Ergebnisse 4.2.2 Charakterisierung Molekulargewichtsbestimmung: Das Molekulargewicht des isolierten Gesamtkomplexes MtrA-H wurde bestimmt, um eine

4 Ergebnisse Abbildung 4.5: Coomassie-gefärbte Blaue Native Page zur Molekulargewichtsbestimmung des Gesamtkomplexes MtrA-H. Auf Bahn 1 sind die zur G

4 Ergebnisse Tabelle 4.2: Übersicht über die verschiedenen Methoden und Pufferbedingungen zur Abtrennung der Untereinheit MtrH vom gereinigten Gesamtk

4 Ergebnisse Western Blot mit Anti-M. marburgensis MtrH-Antikörpern: Der vollständig gereinigte Mtr-Komplex mit Untereinheit MtrH (MtrA-H) sowie der n

ZUSAMMENFASSUNG In dieser Arbeit sollte die Bindung von Tetrahydromethanopterinderivaten an zwei Enzyme des methanogenen, CO2-reduzierenden Energiest

4 Ergebnisse 4.2.3 Kristallisation Für die Kristallisationsversuche des Gesamtkomplexes MtrA-H lag dieser im Kristallisationspuffer (50 mM MOPS/KOH p

4 Ergebnisse b) a) Abbildung 4.7: a) Elektronenmikroskopische Aufnahme des Mtr-Komplexes nach Negativfärbung mit 1 % Uranylacetat. Die Partikel ersche

4 Ergebnisse die als Einkerbung erscheinen, und einem kleineren, spitzen Teil von ca. 41 Å, sodass das Molekül insgesamt wie eine Pyramide erscheint.

4 Ergebnisse b) a) Abbildung 4.8: a) Iterative Berechnung der Struktur des Mtr-Komplexes. Aus 7380 Einzelpartikeln wurden neun Klassensummen berechnet

4 Ergebnisse 4.3 Ergebnisse der heterologen Expression der Untereinheiten MtrA und MtrH Mit sämtlichen hergestellten Vektorkonstrukten (siehe Tabell

4 Ergebnisse Tabelle 4.3: Übersicht über die Ergebnisse der durchgeführten Expressionsversuche der rekombinanten Untereinheiten MtrA und MtrH des Mtr-

4 Ergebnisse 4.4 Rekombinantes des-[225-246]-MtrA (MJMtrA3) aus M. jannaschii 4.4.1 Reinigung Des-[225-246]-MtrA (MJMtrA3) aus M. jannaschii konnte

4 Ergebnisse 4.4.2 Charakterisierung Proteinidentifizierung und Untersuchung der Cofaktor-Bindung durch analytische Gelfiltration: MJMtrA3 wurde bei

4 Ergebnisse ESI-MS-Analyse: Die Analyse wurde von der Firma Proteome Factory (Berlin) durchgeführt. Dazu wurde die zu untersuchende Bande aus einem S

4 Ergebnisse sowie selbst hergestellte Reservoirlösungen (siehe Tabelle 4.4) kamen zum Einsatz. Außerdem wurden Tropfengrößen von 0,4-2 µL und verschi

Parallel zu den Untersuchungen am Gesamtkomplex sollten die den Cobamid-Cofaktor bindende Untereinheit MtrA sowie die H4MPT-bindende Untereinheit MtrH

4 Ergebnisse Bindung von MKMtrA an die Strep-Tactin®-Säule nachweisen. Diese Bindung geschah nur unvollständig, da sich MKMtrA sowohl im Säulendurchfl

4 Ergebnisse 4.6 Rekombinantes M. marburgensis MtrH (MMRMtrH) Rekombinantes M. marburgensis MtrH, im folgenden MMRMtrH genannt, konnte, wie in Abschn

4 Ergebnisse 4.7 Co-Expression und gemeinsame Reinigung von des-[225-246]-MtrA und MtrH (MJMtrA3+MJMtrH) aus M. jannaschii Die Co-Expression von des

4 Ergebnisse Superdex 200 MJMtrH + MJMtrA30,00,10,20,30,40,50,4 0,9 1,4 1,9 2,4Elutionvolumen/[mL]Absorption 280 nm/[mAU]0,000,060,12Absorption 365 nm

4 Ergebnisse 4.8 Die F420-abhängige N5,N10-Methylen-H4MPT-Dehydrogenase (KMtd) aus M. kandleri 4.8.1 Co-Kristallisation von KMtd mit H4MPT-Derivaten

4 Ergebnisse Abbildung 4.15: Kristalle von KMtd im Komplex mit dem Substrat Methylen-H4MPT und dem Cosubstrat F420. Die Kristalle entstanden unter ana

4 Ergebnisse Verfeinerung geschah schrittweise mittels REFMAC und Coot. Für das Substrat Methylen-H4MPT sowie das Cosubstrat F420 wurden zunächst sepa

4 Ergebnisse 4.8.3 Strukturbeschreibung Die Bindetasche von Methylen-H4MPT und F420: Methylen-H4MPT und F420 sind in eine Spalte zwischen der α, β-

4 Ergebnisse Abbildung 4.16: Übersicht der Bindetasche von Methylen-H4MPT und F420. Die α, β-Domäne ist in blau, die Helixbündeldomäne in rot und das

4 Ergebnisse von Ionenbindungen zwischen Arg129 und Lys43 des betrachteten Monomers und Asp25, Glu26, Arg27, Asp29, Arg30, Asp162 und His266 des Gegen