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Parallel zu den Untersuchungen am Gesamtkomplex sollten die den Cobamid-

Cofaktor bindende Untereinheit MtrA sowie die H

MPT-bindende Untereinheit MtrH

in für die Kristallisation und röntgenkristallographische Untersuchung ausreichender

Menge und Qualität gereinigt werden. Hierfür wurden MtrA und MtrH aus oben

genannten Organismen für die heterologe Expression in E. coli kloniert, die

Expressionsbedingungen optimiert und Reinigungsprotokolle etabliert. Anschließend

wurden die Untereinheiten umfangreichen Kristallisationsversuchen unterzogen.

Die Untereinheit MtrA aus M. jannaschii konnte ohne die C-terminale

Transmembranhelix als lösliches Protein in E. coli produziert und als Holoprotein bis

zur Homogenität gereinigt werden. Zur Kristallisation kam es jedoch vermutlich

aufgrund der außergewöhnlich guten Löslichkeit nicht. Bei M. kandleri MtrA gelang

die Herstellung von geringen Mengen teilweise löslichen StrepII-Fusionsproteins

ohne C-terminale Transmembranhelix in E. coli.

Eine Produktion der Untereinheit MtrH in E. coli als lösliches Protein war bei

keiner der in dieser Arbeit getesteten Varianten möglich. Mit dem in

Einschlusskörperchen exprimierten Protein aus M. marburgensis wurde eine

Reinigung und Rückfaltung versucht, was jedoch nicht bis zur Homogenität gelang.

Auch eine Co-Expression der Untereinheiten MtrA und MtrH, durch welche eine

bessere Faltung und Löslichkeit erreicht werden sollte, war nur in

Einschlusskörperchen möglich, deren gemeinsame Reinigung und Rückfaltung

jedoch nicht gelang.

Das zweite in dieser Arbeit untersuchte Enzym, die F

420

-abhängige

-Methylen-H

MPT-Dehydrogenase (Mtd), katalysiert den reversiblen,

stereospezifischen Hydrid-Transfer zwischen reduziertem F

420

) und Methenyl-

MPT

, welches hierbei zu Methylen-H

MPT reduziert wird. Die Reaktion verläuft

über einen ternären Komplex bestehend aus Protein, Substrat (Methylen-H

MPT)

und Cosubstrat (F

420

), welcher strukturell charakterisiert werden sollte. Das

gereinigte, rekombinante Enzym aus M. kandleri wurde mit verschiedenen H

MPT-

und F

420

-Derivaten co-kristallisiert, die Struktur des ternären Komplexes

röntgenkristallographisch bestimmt und die Bindung von H

MPT und F

420

analysiert.

Methenyl-H

MPT

und F

420

sind in der in dieser Arbeit gelösten Kristallstruktur in

katalytisch aktiver Konformation gebunden, jedoch kann bei einer Auflösung von

1,8 Å nicht beurteilt werden, ob Methylen-H

MPT und F

420

oder Methenyl-H

MPT

und F

420

vorlagen. Ein Vergleich mit der Struktur von M. kandleri-Mtd (KMtd) ohne

Substrat und Cosubstrat ergab nur äußerst geringe Abweichungen in der

Proteinkonformation, sodass sich KMtd überraschenderweise als Beispiel für ein

Enzym mit ungewöhnlich starrer, vorgegebener Bindetasche erwies.

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