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4.2 Der N

-Methyl-H

MPT:Coenzym M Methyltransferasekomplex aus

M. marburgensis

4.1.4 Isolierung und Reinigung

Membranpräparation und Solubilisierung:

Für die Reinigung des Gesamtkomplexes MtrA-H wurden die M. marburgensis-

Zellen wie in Abschnitt 3.5.1 beschrieben im Hochdruckhomogenisator

aufgeschlossen. Dadurch konnte der Anteil an vollständigem, Untereinheit MtrH

enthaltendem Komplex in der Membranfraktion erhöht werden. Wie hoch dieser

Anteil war, konnte jedoch erst nach dem ersten säulenchromatographischen

Reinigungsschritt anhand einer Analyse mittels SDS-Page der hierbei gesammelten

Fraktionen bestimmt werden (siehe folgender Abschnitt). Um erwähnten Anteil zu

erhöhen, wurden neben unterschiedlichen Aufschlussmethoden auch verschiedene

Pufferlösungen zur Membranpräparation und Solubilisierung getestet. Die pH-Werte

wurden zwischen 4,0 und 7,0, der NaCl-Gehalt von 0-2 M variiert und LM wurde

gegen 2,5 % (w/v) CHAPS ausgetauscht. Es zeigte sich jedoch, dass dadurch kaum

Einfluss auf den Gehalt der Fraktionen an MtrH genommen werden konnte, woraus

geschlossen wurde, dass dieser vor allem vom möglichst schonenden Zellaufschluss

abhängig war.

Dies wurde sich im Umkehrschluss bei der Reinigung des Komplexes MtrA-G

ohne Untereinheit MtrH zunutze gemacht, indem die Zellen mittels Ultraschall

aufgeschlossen und die aus dem Lysat a/jointfilesconvert/483107/bgetrennten Membranen bei insgesamt

zwei Waschschritten wiederum mit Ultraschall behandelt wurden (siehe Abschnitt

3.5.1). Durch diese Vorgehensweise bei der Membranpräparation wurde Untereinheit

MtrH bereits größtenteils aus dem Komplexverband gelöst, wie sich nach der

Analyse der bei der Ionenaustauschchromatographie auf DEAE-Sepharose

gesammelten Fraktionen und der vollständig gereinigten Proben zeigte (siehe

folgender Abschnitt).

Sowohl MtrA-H als auch MtrA-G wurden schließlich mit 2,5 % LM solubilisiert und

die restlichen Membranteile durch Ultrazentrifugation a/jointfilesconvert/483107/bgetrennt.

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