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3 Methoden

resuspendiert, mit einem Dispergiergerät homogenisiert und erneut zentrifugiert

(100 000 x g, 1 h, 4˚C). Beim zweiten Waschschritt wurde in 50 mL Waschpuffer 1

(50 mM MOPS/KOH pH 7,0, 10 mL MgCl

, 2 mM DTT, 0,05 % (w/v) LM)

resuspendiert, homogenisiert und zentrifugiert (100 000 x g, 1 h, 4˚C). Die

Membranen wurden bis zur weiteren Verwendung mit 15 mL Waschpuffer in

flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C verwahrt.

Zur Reinigung des Mtr-Komplexes ohne Untereinheit MtrH (MtrA-G) wurde eine

a/jointfilesconvert/483107/bgewandelte Version des oben beschriebenen Protokolls verwendet. 40 g Zellen

wurden in 1,75 mL Lysepuffer 2 (50 mM TRIS/HCl pH 7,6, 2 mM DTT) pro g

Bakterienfeuchtgewicht resuspendiert, durch Ultraschall-Behandlung (7 x 8 min mit je

5 min Pause, Puls: 50 %, Leistung: 5 W, 0 °C) aufgeschlossen und zentrifugiert

(13 000 x g, 2 x 30 min, 4 °C).

Durch Ultrazentrifugation (150 000 x g, 2 h, 4˚C) wurden die Membranen

a/jointfilesconvert/483107/bgetrennt und der Überstand verworfen. Die Membranen wurden in 20 mL

Lysepuffer 2 resuspendiert, homogenisiert und 8 min mit Ultraschall (Puls: 50 %,

Leistung: 5 W, 0 °C) behandelt. Nach erneuter Ultrazentrifugation (150 000 x g,

1,5 h, 4˚C) wurden die Membranen ein zweites Mal mit 20 mL Waschpuffer 2 (50 mM

TRIS/HCl pH 7,6, 2 mM DTT, 0,05 % (w/v) LM) gewaschen indem sie ebenfalls

homogenisiert, mit Ultraschall behandelt (8 min, Puls: 50 %, Leistung: 5 W, 0 °C) und

abzentrifugiert (150 000 x g, 1,5 h, 4˚C) wurden.

3.5.2 Isolierung und Reinigung des Mtr-Komplexes aus M. marburgensis

Die Reinigung des Gesamtkomplexes (MtrA-H) und des Mtr-Komplexes ohne

Untereinheit MtrH (MtrA-G) wurde in a/jointfilesconvert/483107/bgewandelter Form nach Gärtner et al. (56)

durchgeführt (zur Übersicht siehe Abbildung 3.1). Alle chromatographischen

Reinigungsschritte erfolgten mit dem ÄKTA purifier™-System (GE Healthcare,

München) bei RT, wobei durch Absorptionsmessung bei 280 nm und 365 nm, dem

Absoptionsmaximums des Corrinoid-Cofaktors, detektiert wurde. Die Fraktionen

wurden mittels SDS-Page (siehe Abschnitt 3.4.2) auf ihren Gehalt an Mtr-Komplex

überprüft.

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