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4 Ergebnisse

4.1 Planung und Herstellung der Vektorkonstrukte

4.1.1 Sekundärstrukturanalyse zur Planung der Konstrukte MJmtrA1,

MJmtrA2 und MJmtrA3

Vor der Planung der Vektorkonstrukte zur rekombinanten Erzeugung von

Untereinheit MtrA aus M. jannaschii wurde eine Sekundärstrukturanalyse mit Hilfe

der Programme PredictProtein und SOSUI durchgeführt. Basierend auf der PHD-

Methode, die PredictProtein verwendet, wurde eine die achtzehn C-terminalen

Aminosäurereste (AS 228-245) umfassende Transmembranhelix identifiziert. Durch

SOSUI ergab sich davon abweichend eine C-terminale Transmembranhelix von 22

Aminosäureresten (AS 224-245). Daraufhin wurden drei verschiedene Konstrukte,

zum einen zur vollständigen Expression (MJmtrA1), zum anderen um die

Hydrophobizität des Proteins zu senken zur Expression zweier verkürzter Proteine

MJmtrA2 (achtzehn C-terminale AS fehlen) und MJmtrA3 (22 C-terminale AS fehlen),

angefertigt.

4.1.2 Sequenzvergleich zur Planung der Konstrukte MKmtrH1 und MKmtrH

Für die Produktion von M. kandleri MtrH in E. coli wurden zwei verschiedene

Vektorkonstrukte hergestellt. Das eine enthielt eine vollständig Version des Gens

(pCHis_tet(mtrH1) bzw. MKmtrH1), im zweiten wurde das Gen um die für die elf

N-terminalen Aminosäuren codierenden Basenpaare verkürzt (pCHis_tet(mtrH2)

bzw. MKmtrH2). Diese Verkürzung wurde vorgenommen, da ein Sequenzvergleich

von MtrH aus M. marburgensis, M. jannaschii und M. kandleri mit der

5-Methyltetrahydrofolat Corrinoid/Eisen-Schwefel-Protein Methyltransferase aus

Moorella thermoacetica (Clostridium thermoaceticum), die ebenfalls Pterin bindet und

deren Kristallstruktur bereits vorliegt (RCSB-Proteindatenbankeintrag 1F6Y) (132),

zeigte, dass bei ansonsten großer Sequenzhomologie der Hauptunterschied aus

jenen bei M. thermoacetica fehlenden 11 N-terminalen Aminosäuren bestand (siehe

Abbildung 4.1). Außerdem wurde den Konstrukten MKmtrH1 und MKmtrH2 jeweils

ein C-terminales His

-Affinitätspeptid angehängt.

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