MTD 243-670 Manual do Utilizador descarregar pdf (Página 90)

4 Ergebnisse

Bindung von MKMtrA an die Strep-Tactin

-Säule nachweisen. Diese Bindung

geschah nur unvollständig, da sich MKMtrA sowohl im Säulendurchfluss als auch in

der Elutionsfraktion wiederfand. Darüber hinaus trat teilweise eine weitere Bande bei

ca. 6 kDa auf, die jedoch nicht identifiziert werden konnte.

Als weitere Identifikationsmethode wurde eine MALDI-TOF-Fingerprint-Analyse

nach dem Trypsin-Verdau der im Western Blot sichtbaren Banden versucht. MtrA

aus M. kandleri konnte mit dieser Methode jedoch nicht nachgewiesen werden.

Aufgrund der mangelnden Expression und der Schwierigkeiten bei der Identifikation

wurden die Versuche mit pCSt_tet(mtrA) bzw. MKMtrA a/jointfilesconvert/483107/bgebrochen.

Abbildung 4.12: Western Blot mit Anti-StrepII-Antikörpern von Proben der Expression in

E. coli und Reinigung auf Strep-Tactin

von des-[238-252]MtrA mit C-terminalem StrepII-

Affinitätspeptid aus M. kandleri (MKMtrA). Auf Bahn 1 ist die lösliche Fraktion, auf Bahn 2 die

unlösliche Fraktion nach dem Zellaufschluss zu sehen. In beiden Proben ist MKMtrA zu

finden. Auf Bahn 3 wurde der Überstand nach der Hitzefällung und Entfernung der E. coli-

Proteine mittels Ultrazentrifugation aufgetragen. Auf Bahn 4 befindet sich der Durchfluss nach

Auftragen der Probe auf die Strep-Tactin

-Säule. Auf Bahn 5 ist MKMtrA nach der Elution mit

2 mM D-Biotin zu sehen. Die zwei letzten Proben zeigen, dass MKMtrA nur teilweise an das

Säulenmaterial gebunden wurde. Die schwächere Bande bei ca. 6 kDa konnte nicht

identifiziert werden. Auffällig ist bei allen Proben das apparente Molekulargewicht von ca.

16,5 kDa, das vom errechneten Wert von 27 kDa stark abweicht.

1 2 ... 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 ... 143 144

Sem comentários

MTD 243-670 Manual do Utilizador Página 90