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3 Methoden

Benzonase

Nuclease (Novagen, Darmstadt) und 5 µg Lysozym versetzt und 30 min

bei RT inkubiert. Bei den vor der Induktion genommenen Proben wurde zur Analyse

der gesamten in der Zelle enthaltenen Proteine 15 µL dieses Zelllysats mit 5 µL

5x SDS-Probenpuffer (250 mM TRIS/HCl pH 6,8, 500 mM DTT, 10 % (w/v) SDS,

0,5 % Bromphenolblau, 10 % (v/v) Glycerin) versetzt und 15 min auf 99 °C erhitzt.

Das restliche Lysat wurde zentrifugiert (13000 x g, RT, 10 min), das Pellet (unlösliche

Fraktion/Membranfraktion) in 25 µL SDS-Lösung (1 % w/v) unter Erhitzen auf 99 °C

gelöst und 5-15 µL davon mit 5 µL SDS-Probenpuffer versetzt. 10-15 µL des

Überstand (lösliche Fraktion/cytosolische Fraktion) wurden ebenfalls mit 5 µL SDS-

Probenpuffer versetzt und 15 min auf 99 °C erhitzt. Die Proben wurden anschließend

per SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (siehe Abschnitt 3.4.2) und Western Blot

(Abschnitt 3.4.4) analysiert.

3.4 Proteinbiochemische Methoden

3.4.1 Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Proteinkonzentration einer Lösung wurde nach Bradford bestimmt (114).

Dieser Test beruht auf einer Verschiebung des Absorptionsmaximums der freien

kationischen Form von Coomassie Brilliant Blue G-250 (im Bradford-Reagenz

„Bio-Rad Protein Assay“, Bio-Rad Laboratories, München enthalten) bei 470 nm zu

595 nm bei der anionischen, an Arginin und aromatische Aminosäurereste

gebundenen Form.

Die Proteinbestimmung wurde anhand einer Eichgeraden, bei der A

595

gegen die

Konzentration an BSA (1-5 µg/mL) aufgetragen wurde, durchgeführt.

3.4.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Page)

Für die SDS-Gelelektrophorese wurden vertikale Minigele mit 4 %-igem

Sammelgel (4 % (w/v) Acrylamid, 0,1 % (w/v) Bisacrylamid, 125 mM TRIS/HCl

pH 6,8, 0,1 % (w/v) SDS, 0,1 % (w/v) APS, 0,01 % (v/v) TEMED) und 15 %-igem

Trenngel (15 % (w/v) Acrylamid, 0,4 % (w/v) Bisacrylamid, 375 mM TRIS/HCl pH 8,8,

0,1 % (w/v) SDS, 0,1 % (w/v) APS, 0,01 % (v/v) TEMED) nach der Methode von

Laemmli (115) verwendet.

Je 15 µL Probe wurde mit 5 µL 5x Probenpuffer (250 mM TRIS/HCl pH 6,8,

500 mM DTT, 10 % (w/v) SDS, 0,5 % Bromphenolblau, 10 % (v/v) Glycerin)

gemischt, bis zu 15 min auf 99 °C erhitzt und in die Geltaschen pipettiert. Als interner

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