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3 Methoden

entstand aus der spontanen Reaktion von H

MPT mit Formaldehyd und

anschließender Lyophilisierung. Chemisch synthetisiertes F

wurde von Herrn Prof.

Dr. Thomas Carell (Fakultät für Chemie und Pharmazie, Ludwig-Maximilians-

Universität München) zur Verfügung gestellt.

3.6 Röntgenkristallographische Methoden

3.6.1 Kristallisation

Um die Proteinlösungen für die Kristallisation zu verwenden, wurde falls nötig ein

Pufferwechsel mittels Dialyse oder einer Entsalzungssäule (PD-10 Desalting

Column, GE Healthcare, München) durchgeführt und bis zu einer geeigneten

Proteinkonzentration eingeengt. Die eingesetzten Proteinlösungen sind in Tabelle 3.8

aufgeführt. Alle Kristallisationsversuche wurden mittels Gasphasendiffusion

durchgeführt.

Tabelle 3.8: Für die Kristallisation verwendete Proteinlösungen.

Protein Konzentration Puffer

Mtr(A-H) aus M. marburgensis 22 mg/mL 50 mM MOPS/KOH pH 7,0

10 mM MgCl

100 mM Ammoniumsulfat

10 % Glycerin

2 mM DTT

0,1 % LM

MJMtrA3 20-92 mg/mL 10-50 mM MOPS/KOH pH 7,0

0-100 mM NaCl

0-100 mM Ammoniumsulfat

2,5-20 % Glycerin

0-1 mM DTT

0-2 mM Vitamin B

12a

KMtd 15 mg/mL 10 mM MES pH 5,5

5 mM Methylen-H

MPT

bzw. 5 mM Methenyl-H

MPT

1 mM F

bzw. 5 mM F

420

Zum Auffinden von initialen Kristallisationsbedingungen wurde die sitting drop-

Methode in Kristallisationsplatten mit 96 Vertiefungen verwendet. Als

Reservoirlösung wurden 90-100 µL der kommerziell erhältlichen Sparse matrix

screens oder selbst entwickelte Screens eingesetzt. In den dafür vorgesehenen

Vertiefungen wurden je 0,2-1 µL Proteinlösung und Reservoirlösung gemischt, die

Platten mit Klebeband versiegelt und bei 4 °C oder 18 °C gelagert.

Zur Verfeinerung der erfolgreichen Bedingungen wurde die Hanging drop-

Methode in Kristallisationsplatten mit 24 Vertiefungen, die mit silanisierten

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