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4.6 Rekombinantes M. marburgensis MtrH (MMRMtrH)

Rekombinantes M. marburgensis MtrH, im folgenden MMRMtrH genannt, konnte,

wie in Abschnitt 3.3.3 beschrieben, mittels des Plasmids MMRmtrH/pET22b+ in

E. coli BL21 (DE3) in größeren Mengen als Einschlusskörperchen produziert werden

(siehe Abbildung 4.13). Diese wurden nach dem Zellaufschluss mit Ultraschall mit

5 M Guanidinhydrochlorid solubilisiert. Nach einer Gelfiltration auf Superdex 200 im

entfalteten Zustand wurden die durch Absorption bei 280 nm als proteinhaltig

identifizierten Fraktionen vereinigt, konzentriert und bei 1000-facher Verdünnung mit

0,05 % LM rückgefaltet. Als abschließender Reinigungsschritt wurde wiederum eine

Gelfiltration auf Superdex 200 durchgeführt und die eluierten Fraktionen mittels

SDS-Page analysiert (siehe Abschnitt 3.5.3).

Die Gelfiltration des rückgefalteten Proteins ergab keinen basisliniengetrennten

Peak und die Analyse der gesammelten Fraktionen mittels SDS-Page (siehe

Abbildung 4.13) zeigte zwar eine Anreicherung von MMRMtrH, jedoch waren auch

zahlreiche weitere Banden unklarer Identität zu sehen. Darüber hinaus bestand keine

Möglichkeit, die korrekte Faltung des Proteins zu überprüfen, sodass weitere

Rückfaltungs- und Reinigungsversuche eingestellt werden mussten.

Abbildung 4.13: Coomassie-gefärbte SDS-Page mit Proben der Produktion in E. coli und

Reinigung von rekombinantem M. marburgensis MtrH (MMRMtrH). Auf Bahn 1 befindet sich

die lösliche Fraktion, auf Bahn 2 die unlösliche Fraktion einer Probe der Zellsuspension drei

Stunden nach Induktion. MMRMtrH (33 kDa) ist in letzterer zu finden, da es in

Einschlusskörperchen exprimiert wird. Auf Bahn 3 ist eine Probe von MMRMtrH nach der

zweiten Gelfiltration im rückgefalteten Zustand zu sehen. Neben MMRMtrH sind noch

zahlreiche weitere Banden mit unklarer Identität zu erkennen.

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