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Präparative Gelfiltration:

Als letzter Reinigungsschritt wurde mit den jeweils vereinigten Fraktionen der

Ionenaustauschchromatographie auf Q-Sepharose eine Gelfiltration durchgeführt.

Hierbei konnten einige niedermolekulare Verunreinigungen und ein nicht Basislinien-

getrennter Peak bei ca. 350 kDa a/jointfilesconvert/483107/bgetrennt werden sowie Proteinkomplex MtrA-H in

den für die Lagerung bei -80 °C geeigneten Gelfiltrationspuffer mit 10 % (w/v)

Glyceringehalt überführt werden. Die MtrA-H (66-77 mL; ca. 670 kDa) bzw. MtrA-G

(63-80 mL; ca. 640 kDa) enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt (siehe

Abbildung 4.4) und die Ausbeute auf 3-7 mg pro 60 g Bakterienfeuchtgewicht für

MtrA-H bzw. 8 mg pro 60 g Bakterienfeuchtgewicht für MtrA-G mittels Bradford-Test

bestimmt. MtrA-H war bei -80 °C mehrere Wochen stabil, wie durch analytische

Gelfiltration gezeigt werden konnte.

Superose 6 MtrA-H

-5

145

195

245

295

345

0 20 40 60 80 100 120

Elutionvolumen/[mL]

Absorption 280 nm/[mAU]

-2

Absorption 365 nm/[mAU]

280 nm

365 nm

Fraktionen mit MtrA-H

~ 670 kDa

~ 350 kDa

Superose 6 MtrA-G

-5

145

195

245

295

0 20 40 60 80 100 120

Elutionvolumen/[mL]

Absorption 280 nm/[mAU]

-2

Absorption

365 nm/[mAU]

280 nm

365 nm

Fraktionen mit

MtrA-G

~ 640 kDa

~ 350 kDa

Abbildung 4.4: Elutionsprofile und Coomassie-gefärbte SDS-Pages nach der Gelfiltration

der Mtr-Komplexe mit und ohne Untereinheit MtrH auf Superose 6. Es wurden jeweils nur die

zum Hauptpeak bei 670 kDa bzw. 640 kDa gehörenden Fraktionen vereinigt. Auf Bahn 1 der

SDS-Page ist der vollständige, gereinigte Komplex MtrA-H zu sehen. Auf Bahn 2 wurde der

Komplex MtrA-G mit nur sehr wenig MtrH (34 kDa) nach dem letzten Reinigungsschritt

aufgetragen. Die unidentifizierte Bande bei ca. 30 kDa konnte nicht a/jointfilesconvert/483107/bgetrennt werden.

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