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3 Methoden

Matrix-unterstützte Laserdesorptions/Ionisations-Massenspektrometrie mit

Flugzeitmassen-Analyse (MALDI-TOF):

Bei dieser Methode werden die Peptidfragmente oder Proteine mit einer

Matrixsubstanz (α-Cyano-4-hydroxy-Zimtsäure) co-kristallisiert. Die Matrix wird nun

im Hochvakuum durch Laserbeschuss verdampft, sodass die zu untersuchenden

Moleküle mitgerissen und gleichzeitig ionisiert werden. Die Ionen werden im

elektrischen Feld beschleunigt und die Flugzeit mittels eines Flugzeitmassen-

Analysators gemessen. Hierbei gilt:

tof ∝

Gleichung 3.1

tof: Flugzeit (time of flight)

m: Masse

z: Ladungszahl

Das erhaltene Masse/Ladungs-Spektrum wird ebenfalls durch

Datenbanka/jointfilesconvert/483107/bgleich mittels des Programms Mascot analysiert.

Der Vorteil der Methode liegt darin, dass auch große Massen, d.h. komplette

Proteine sowie hydrophobe Proben, detektiert werden können.

Innerhalb dieser Arbeit wurden Peptidfragmente nach Trypsinverdau von

MJMtrA3 (heterolog exprimiertes des-[225-246]-MtrA aus M. jannaschii) und von

verschiedenen Untereinheiten des Mtr-Gesamtkomplexes aus M. marburgensis

sowie MKMtrA aus SDS-Polyacrylamidgelbanden von Herrn Jörg Kahnt am

Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie in Marburg analysiert.

3.5 Proteinreinigung

3.5.1 Membranpräparation aus M. marburgensis-Zellen

Zur Präparation der Membranen aus M. marburgensis unter aeroben

Bedingungen wurde das von Gärtner et al. (56) etablierte Protokoll modifiziert. 60 g

Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in 3-5 mL Lysepuffer 1 (50 mM MOPS/KOH

pH 7,0, 10 mL MgCl

, 2 mM DTT) pro g Bakterienfeuchtgewicht resuspendiert. Nach

Zugabe von 30 mg DNAse I wurde im Hochdruckhomogenisator (4 x 80 psi/100 bar,

0 °C) aufgeschlossen und das Zelldebris abzentrifugiert (15 000 x g, 2 x 30 min,

4 °C).

Aus dem Überstand wurde durch Ultrazentrifugation (100 000 x g, 3 h, 4˚C) die

Membranfraktion a/jointfilesconvert/483107/bgetrennt. Diese wurde sodann in 50 mL Lysepuffer 1

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