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3 Methoden

Deckplättchen und Silikonfett a/jointfilesconvert/483107/bgedichtet wurden, verwendet. Das Volumen der

Reservoirlösung betrug hier 0,5-1 mL, der Tropfen bestand aus 1 µL Bodenlösung

und 1 µL Proteinlösung.

Die Co-Kristallisation von KMtd mit Substrat und Cosubstrat wurde von Frau

Ulrike Demmer (Max-Planck-Institut für Biophysik, Frankfurt) im Anaerobenzelt und

unter Rotlicht durchgeführt. Sämtliche Lösungen wurden dazu anaerobisiert und je

500 µL Reservoirlösung in Sitting drop-Kristallisationsplatten mit 24 Vertiefungen

gefüllt. Je 1 µL Reservoirpuffer wurde mit 1 µL Proteinlösung in den dafür

vorhergesehenen Vertiefungen gemischt, die Platten mit Klebeband verschlossen

und bei 20 °C gelagert.

Zum Einfrieren der Proteinkristalle vor der röntgenographischen Untersuchung

wurde zunächst das Auftreten von Eisringen im Streubild der mit verschiedenen

Glycerin- oder PEG-Konzentrationen als Frostschutzmittel versetzten

Reservoirlösung überprüft. War die geringst mögliche Frostschutzmittelkonzentration

gefunden, wurden die Kristalle darin kurz inkubiert, mit einem passenden Cryo-loop

eingefangen und im laminaren Stickstoffstrom bei 100 K eingefroren. Bis zur

Messung wurden die Kristalle in flüssigem Stickstoff gelagert.

3.6.2 Datensammlung und -prozessierung

Sämtliche Daten zur Röntgenstrukturanalyse wurden am SLS (Synchrotron,

Villigen, Schweiz), Beamline PX02 gemessen. Die Rotation pro image betrug

standardmäßig 0,5° bei einer Wellenlänge von ca. 1 Å (12,3984 keV).

Die gesammelten Daten wurden mittels des Programms XDS prozessiert (99),

wobei zunächst die möglichen Bravais-Typen bestimmt und die Reflexe

entsprechend indiziert wurden. Die Raumgruppe konnte anhand der Statistiken für

die jeweilige Raumgruppe sowie die Analyse von Auslöschungen durch

Schraubenachsen bestimmt werden. Danach konnten die indizierten und integrierten

Reflexintensitäten mittels der Programme XSCALE und XDSCONV skaliert und

reduziert sowie die Friedel-Paare zusammengefasst werden.

Um die Anzahl von Monomeren pro asymmetrischer Einheit voraussagen zu

können, wurde der Matthews-Koeffizient V

nach Gleichung 3.2 mit dem Programm

MATTHEWS_COEFF (ccp4-suite) berechnet. Werte von n, für die V

zwischen

1,7 Å

/Da und 3,5 Å

/Da liegt, entsprechen nach Gleichung 3.3 einem Solvensgehalt

von 27-65 %. Laut statistischen Untersuchungen liegt der Solvensgehalt von

Proteinkristallen am häufigsten bei 43 % und der V

somit bei 2,2 Å

/Da (126). Werte

von n, für die V

nahe dem statistischen Maximum liegt, sind somit wahrscheinlich.

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