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3 Methoden

3.2 Molekularbiologische Methoden

3.2.1 Extraktion und Reinigung genomischer DNA aus Archaeen-Zellen

Zur Extraktion der genomischen DNA aus Archaeen-Zellen nach Kiener et al.

(110) und Marmur und Doty (111) wurden 2 g Methanocaldococcus jannaschii-Zellen

unter flüssigem Stickstoff mit Mörser und Stößel aufgeschlossen und in 14 mL

Saccharose-TE-Puffer (20 mM TRIS/HCl pH 8,0, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 %

Saccharose) mit 2,8 mg Proteinase K resuspendiert. Nach einstündiger Inkubation

bei 37 °C wurde mit 2 % SDS (Endkonzentration) versetzt und wiederum 1 h bei

60 °C inkubiert. Nach Zugabe von 3,5 mL 5 M NaCl-Lösung wurde 1 h auf Eis

inkubiert und schließlich zentrifugiert (20000 x g, 4 °C, 30 min).

Die DNA wurde durch Zugabe des einfachen Volumens an eisgekühltem

Isopropanol aus dem Überstand gefällt und auf einen Glasstab gewickelt. Nach

Waschen mit 70 % Ethanol ließ man die DNA trocknen und löste sie schließlich in

10 mL TE-Puffer (20 mM TRIS/HCl pH 8,0, 5 mM EDTA pH 8,0). Anschließend

wurde 1 mg Proteinase K zugegeben und bei 37 °C für 1 h inkubiert.

Durch dreimalige Zugabe von Phenol/Chloroform im Verhältnis 5:1,

zehnminütiger Inkubation unter Schütteln und anschließender Zentrifugation

(4500 x g, 4 °C, 20 min) wurde die DNA von Protein gereinigt.

Zur Entfernung von Salzen und Nukleotiden wurde Na-Acetat-Puffer (3 M

Na-Acetat pH 5,2) im Verhältnis 1:10 sowie das dreifache Volumen an eisgekühltem

Ethanol und zentrifugiert (4500 x g, 4 °C, 20 min). Das Pellet wurde mit 1 mL

eisgekühltem Ethanol (70 % v/v) gewaschen, nach erneutem Zentrifugieren

(4500 x g, 4 °C, 20 min) an der Luft getrocknet und schließlich in 3 mL TE-Puffer

resuspendiert.

Um RNA zu entfernen wurde 20 µg/mL RNAse (Endkonzentration) zugegeben,

dreimal mit Phenol/Chloroform extrahiert, erneut mit Na-Acetat sowie Ethanol gefällt,

mit 70 % Ethanol gewaschen und in 3 mL TE-Puffer resuspendiert.

3.2.2 Herstellung künstlicher DNA-Fragmente mittels PCR

Die für MtrH und MtrA aus M. jannaschii codierenden Genabschnitte bzw. deren

verkürzte Varianten wurden mittels Polymerasekettenreaktion amplifiziert. Dabei

wurden durch entsprechende Primer Restriktionsschnittstellen zur Klonierung in

verschiedene Zielvektoren eingeführt (siehe Tabelle 3.2). Die Primer-Sequenzen sind

im Anhang (Abschnitt 7.3) zu finden.

1 2 ... 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 ... 143 144

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