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3.3 Kultivierung von Bakterien 32

3.3.1 Bestimmung der Zelldichte 32

3.3.2 Kultivierung für die Plasmidpräparation 32

3.3.3 Kultivierung für die Proteinproduktion 32

3.3.4 Expressionstest und Optimierung der Proteinexpression 34

3.4 Proteinbiochemische Methoden 35

3.4.1 Bestimmung der Proteinkonzentration 35

3.4.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Page) 35

3.4.3 Blaue Native Polyacrylamidgelelektrophorese (BN-Page) 36

3.4.4 Elektrophoretischer Proteintransfer und direkter ELISA (Western Blot) 37

3.4.5 Analytische Gelfiltration 37

3.4.6 Massenspektrometrie 38

3.5 Proteinreinigung 39

3.5.1 Membranpräparation aus M. marburgensis-Zellen 39

3.5.2 Isolierung und Reinigung des Mtr-Komplexes aus M. marburgensis 40

3.5.3 Reinigung von rekombinantem M. marburgensis MtrH (MMRMtrH) 42

3.5.4 Reinigung von rekombinantem des-[225-246]-MtrA (MJMtrA3) aus

M. jannaschii

3.5.5 Reinigung und Rückfaltung von co-exprimierten des-[225-246]-MtrA

und MtrH (MJMtrA3 + MJMtrH) aus M. jannaschii

3.5.6 Reinigung von rekombinantem des-[238-252]-MtrA mit C-terminalem

StrepII-Anhängsel (MKMtrA) aus M. kandleri

3.5.7 Reinigung von rekombinanter F

420

-abhängiger

-Methylentetrahydromethanopterin-Dehydrogenase (Mtd) aus

M. kandleri

3.6 Röntgenkristallographische Methoden 46

3.6.1 Kristallisation 46

3.6.2 Datensammlung und –prozessierung 47

3.6.3 Lösung des Phasenproblems 48

3.6.4 Modellbau und Verfeinerung 49

3.6.5 Validierung von Proteinstrukturen 49

3.6.6 Strukturdarstellung 50

3.7 Elektronenmikroskopische Einzelpartikelmessung 50

3.7.1 Probenvorbereitung 50

3.7.2 Datensammlung und –prozessierung 51

3.7.3 Datenanalyse und Rekonstruktion 51

4 Ergebnisse

4.1 Planung und Herstellung der Vektorkonstrukte 52

4.1.1 Sekundärstrukturanalyse zur Planung der Konstrukte MJmtrA1,

MJmtrA2 und MJmtrA3

4.1.2 Sequenzvergleich zur Planung der Konstrukte MKmtrH1 und MKmtrH 52

4.1.3 Herstellung der Vektorkonstrukte 53

4.2 Der N

-Methyl-H

MPT:Coenzym M-Methyltransferasekomplex aus

M. marburgensis

4.2.1 Isolierung und Reinigung 54

4.2.2 Charakterisierung 59

4.2.3 Kristallisation 63

4.2.4 Elektronenmikroskopische Einzelpartikelmessung 63

4.3 Ergebnisse der heterologen Expression der Untereinheiten MtrA

und MtrH

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