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3 Methoden

3.1 Planung der Vektorkonstrukte

Das Vektorkonstrukt MMRmtrH/pET22b+ zur rekombinanten Expression der Mtr-

Untereinheit MtrH aus M. marburgensis in E. coli wurde von Frau Dr. Priyamvada

Acharya (Max-Planck-Institut für Biophysik, Frankfurt) zur Verfügung gestellt.

Vor der Planung der Vektorkonstrukte zur rekombinanten Expression der Mtr-

Untereinheit MtrA aus M. jannaschii wurde eine Sekundärstrukturanalyse mit Hilfe

der Programme PredictProtein und SOSUI durchgeführt. Daraufhin wurden drei

verschiedene Konstrukte, zum einen zur vollständigen Expression (MJmtrA1), zum

anderen zur Expression zweier um die C-terminale Transmembranhelix verkürzter

Proteine MJmtrA2 (achtzehn C-terminale AS fehlen) und MJmtrA3 (22 C-terminale

AS fehlen), angefertigt.

Zur Klonierung von mtrH aus M. jannaschii wurde die entsprechende Sequenz

aus der Datenbank entnommen (GenBank Nr. NC_000909) (6).

Zwei weitere Konstrukte wurden zur Co-Expression der verkürzten Untereinheit

MtrA mit der Untereinheit MtrH angefertigt (MJmtrA3/pACYC-Duet1 und

MJmtrH/pACYC-Duet1), um eventuell eine bessere Faltung und Löslichkeit der

Untereinheit MtrH zu erreichen. Hintergrund dieses Ansatzes war, dass MtrA und

MtrH für die Methylübertragung im Komplexverbund in Kontakt miteinander stehen

müssen. Wie stark der Zusammenhalt dieses binären Komplexes außerhalb des

Gesamtkomplexes MtrA-H ausfällt, ist jedoch unklar. Der pACYC-Duet 1-Vektor kann

aufgrund seines von pET-Vektoren verschiedenen Replikationsursprungs und

abweichender Antibiotikaresistenz mit diesen zusammen exprimiert werden.

Zur heterologen Expression von M. kandleri MtrA wurden fünfzehn C-terminale

Aminosäuren durch ein Affinitätspeptid (StrepII) ersetzt.

Für die Produktion von M. kandleri MtrH in E. coli wurden zwei verschiedene

Vektorkonstrukte benutzt. Das eine enthielt eine vollständig Version des Gens

(pCHis_tet(mtrH1) bzw. MKmtrH1), im zweiten wurde nach einem Sequenzvergleich

von MtrH aus M. marburgensis, M. jannaschii und M. kandleri mit der

5-Methyltetrahydrofolat Corrinoid/Eisen-Schwefel-Protein Methyltransferase aus

Moorella thermoacetica (Clostridium thermoaceticum) das Gen um die für die elf

N-terminalen Aminosäuren codierenden Basenpaare verkürzt (pCHis_tet(mtrH2)

bzw. MKmtrH2). Außerdem wurde jeweils ein C-terminales His

-Affinitätspeptid

angehängt. Die für die Produktion der Mtr-Untereinheiten aus M. kandleri

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