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sowie selbst hergestellte Reservoirlösungen (siehe Tabelle 4.4) kamen zum Einsatz.

Außerdem wurden Tropfengrößen von 0,4-2 µL und verschiedene

Lagerungstemperaturen (4 °C und 18 °C) erprobt. Trotz dieser umfangreichen

Versuche konnte keine Kristallisationsbedingung aufgefunden werden. Es zeigte sich

darüber hinaus, dass das Protein selbst bei extremen Bedingungen (hohe

Proteinkonzentration und hoher Fällungsmittelgehalt) stabil war und nur in geringem

Maße ausfiel.

Tabelle 4.4: Zusammensetzung der selbst entwickelten Screens für die Protein-

kristallisation.

Bezeichnung Zusammensetzung

Na/K-Tartrat/Ammoniumsulfat-Screen

(96 Bedingungen)

100 mM Bis-TRIS-Propan

100-375 mM Ammoniumsulfat

1-1,55 M Na/K-Tartrat

Ammoniumsulfat/Glycerin-Screen

(96 Bedingungen)

100 mM HEPES pH 8,5

1,5-2,02 M Ammoniumsulfat

0-15 % Glycerin

4.5 Rekombinantes des-[238-252]-MtrA mit C-terminalem StrepII-

Affinitätspeptid (MKMtrA) aus M. kandleri

Zur Expression von des-[238-252]-MtrA (MKMtrA; 27 kDa) als lösliches Protein

mit StrepII-Affinitätspeptid wurden mit pCSt_tet(mtrA) transformierte E. coli Rosetta

(DE3) pLysS-Zellen verwendet (siehe Abschnitt 3.3.3).

Nach dem Zellaufschluss durch Ultraschall wurde die lösliche Fraktion zur

Fällung der E. coli-Proteine auf 70 °C erhitzt. Die weitere Reinigung gelang

säulenchromatographisch durch Bindung von MKMtrA an Strep-Tactin

und

anschließende Elution mit 2 mM

D-Biotin (siehe Abschnitt 3.5.6). Die während der

Aufreinigung gewonnenen Proben wurden mittels Western Blot mit Anti-StrepII-

Antikörpern analysiert.

Wie auf den Western Blots in Abbildung 4.12 zu sehen, ließ sich MKMtrA nur

teilweise als lösliches Protein in E. coli produzieren. Ein weiterer Teil befindet sich

nach dem Zellaufschluss in der unlöslichen Fraktion. Insgesamt wurde MKMtrA in

relativ geringen Mengen exprimiert. Darüber hinaus betrug das anhand von

SDS-Page und Western Blot geschätzte Molekulargewicht von MKMtrA ca. 16,5 kDa,

was vom berechneten Wert von 27 kDa stark abwich. Das C-terminale Ende von

MKMtrA mit StrepII-Affinitätspeptid ließ sich jedoch durch Western Blot und die

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