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5 Diskussion

in den bisher erfolgten elektronenmikroskopischen Aufnahmen mit Negativfärbung

weniger heterogen erschien. Es besteht also die berechtigte Hoffnung, mit nach dem

neuen, in dieser Arbeit etablierten Reinigungsprotokoll präparierten Proben eine

Strukturbestimmung durch elektronenmikroskopische Einzelpartikelmessung

durchführen zu können.

5.2 Die Untereinheit MtrA des N

-Methyl-H

MPT:CoM-Methyltransferase-

komplexes

5.2.1 Heterologe Expression in E. coli

Die von Harms und Thauer beschriebene Überexpression von

des-[214-239]-MtrA aus M. marburgensis in E. coli als lösliches Protein (143), welche

von Frau Dr. Priyamvada Acharya am Max-Planck-Institut für Biophysik in Frankfurt

reproduziert werden konnte, gab zur Hoffnung Anlass, MtrA aus M. jannaschii und

M. kandleri auf analoge Weise heterolog exprimieren zu können.

Die in dieser Arbeit durchgeführten Expressionsversuche ergaben, dass bei MtrA

aus M. jannaschii die lösliche Expression abhängig von der Temperatur und der zur

Induktion verwendeten IPTG-Konzentration war. Da vollständiges MtrA mit

C-terminaler Transmembranhelix (MJMtrA1) bei Standardbedingungen (LB-Medium,

37 °C Anzuchttemperatur, Induktion mit 1 mM IPTG) löslich, des-[229-246]-MtrA

(MJMtrA2) jedoch nur teilweise löslich und des-[225-246]-MtrA (MJMtrA3) vollständig

unlöslich exprimiert wurde, ist anzunehmen, dass nicht die Hydrophobizität sondern

die Proteinfaltung betreffende Faktoren die wichtigste Rolle spielten. Da durch

Absenken der Anzuchttemperatur auf 28 °C auch MJMtrA2 und MJMtrA3 vollständig

löslich produziert werden konnten und bei MJMtrA3 zudem noch eine sehr hohe

Expressionsrate auffiel, wurde letzteres zur Aufreinigung weiterverwendet. Ob bereits

während der heterologen Expression Cobalamin gebunden wurde, konnte nicht

festgestellt werden. Bei Zugabe von 0,1 mM Vitamin B

12a

zum Anzuchtmedium ließ

sich keine Veränderung des exprimierten Proteins feststellen.

MtrA aus M. kandleri konnte ebenfalls teilweise als lösliches Protein in E. coli

produziert werden, wurde allerdings in nur relativ geringen Mengen exprimiert. Ein

Grund hierfür könnte das im Vektorkonstrukt pCSt_tet(mtrA) zur Induktion

verwendete tet-Repressor-System sein. Für zukünftige Expressionsversuche sollte

die Kombination von Vektor und Wirtszelle neu überdacht werden.

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