MTD 243-670 Manual do Utilizador descarregar pdf (Página 61)

3 Methoden

Nach Zugabe von Vitamin B

12a

bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM wurde

zur Entfernung von ungebundenem Vitamin B

12a

gegen 1 L Gelfiltrationspuffer

(50 mM MOPS/KOH pH 7,0, 100 mM NaCl, 10 % (w/v) Glycerin) über Nacht bei 4 °C

dialysiert.

Die Probe wurde sodann auf 1 mL eingeengt (Konzentrator mit 10 kDa MWCO),

durch eine 0,2 µm-Membran filtriert und in einer Gelfiltration auf Superdex 200

(Superdex 200 16/60 prep grade, CV: 120 mL) über 1,2 CV mit Gelfiltrationspuffer

isokratisch bei 4 °C und einer Flussrate von 0,5 mL/min eluiert. Die Detektion erfolgte

wiederum bei 280 nm und 365 nm. Nach einer SDS-Page zur Identifizierung von

Fraktionen, die MJMtrA3 enthielten, wurden diese vereinigt und einem Bradford-Test

unterzogen.

3.5.5 Reinigung und Rückfaltung von co-exprimierten des-[225-246]-MtrA und

MtrH (MJMtrA3+MJMtrH) aus M. jannaschii

Das wie in Abschnitt 3.3.3 beschrieben gewonnene E. coli-Zellpellet wurde in

3 mL Lysepuffer (50 mM Tris/HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8,0,

1 mM PMSF) pro g Bakterienfeuchtgewicht resuspendiert und mit

267 µg/mL Lysozym und 67 µg/mL DNAse I 30 min bei RT inkubiert. Nach dem

Ultraschallaufschluss (15 min, Puls: 50 %, Leistung: 5 W, 0 °C) wurde zentrifugiert

(43 000 rpm, 30 min, 4 °C), das Pellet in 1 mL Waschpuffer (50 mM MOPS/KOH pH

7,0, 100 mM NaCl, 0,05 % LM) resuspendiert und erneut zentrifugiert (13 000 x g,

30 min, 4 °C).

Die Einschlusskörperchen wurden in 50 µL/mg Entfaltungspuffer

(50 mM MOPS/KOH pH 7,0, 5 M Guanidinhydrochlorid, 100 mM NaCl, 2 mM DTT)

aufgenommen und bei 4 °C über Nacht unter Rühren inkubiert. Anschließend wurde

zentrifugiert (13 000 x g, 30 min, 4 °C) und der Überstand durch eine

0,2 µm-Membran filtriert.

Die Probe wurde nun einer Gelfiltration auf Superdex 200 (Superdex 200

PC 3.2/30, CV: 2,6 mL) mit 1,2 CV Entfaltungspuffer bei 4 °C und Flussrate

50 μL/min unterzogen.

Die laut Absorptionsmessung bei 280 nm proteinhaltigen Fraktionen wurden auf

500 µL (Konzentrator mit 10 kDa MWCO) eingeengt und unter Rühren langsam in

das 100-fache Volumen an Rückfaltungspuffer (50 mM MOPS/KOH pH 7,0,

100 mM NaCl, 0,01 mM Vitamin B

12a

, 0,5 % OG) getropft. Nach fortgesetztem

Rühren bei 4 °C über Nacht wurde die Lösung auf 1 mL (Konzentrator mit

10 kDa MWCO) konzentriert und durch eine 0,2 µm-Membran filtriert.

1 2 ... 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 ... 143 144

Sem comentários

MTD 243-670 Manual do Utilizador Página 61