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ERGEBNISSE KAPITEL 3

mit denen der gesamte Sequenzabschnitt über PCR amplifiziert werden konnte. PCR-

Produkte dienten als Template für Primerwalking. In einigen Fällen enthielt die amplifi-

zierte DNA interne Wiederholungen, so daß innerhalb des PCR-Produktes keine spezi-

fischen Primer für das Primerwalking a/jointfilesconvert/333809/bgeleitet werden konnten. In diesen Fällen wur-

den ausreichende Mengen des repetitiven Bereiches amplifiziert, geschert und für die

Herstellung einer Genbank verwendet. Die Fragmente der Genbank wurden mit den

Standardprimern für Plasmide ansequenziert und aus den Sequenzläufen die repetitiven

Bereiche zusammengesetzt.

R. eutropha enthält fünf ribosomale RNA-Operons mit einer Größe von ca. 5.1

kbp (siehe 3.I.2.3). Zwischen den RNA-Operons bestehen nur geringe Sequenzunter-

schiede, so daß in der Rohassemblierung fast alle Sequenzläufe dieser Regionen zu ei-

nigen wenigen

Pile-ups assembliert wurden (Abb. 3.5). Aus diesem Grund war die ge-

naue Anzahl der RNA-Operons zunächst nicht bekannt. Da die Größe der RNA-

Operons die durchschnittliche Länge der Inserts der Plasmidbank übersteigt, konnten

diese Fehlassemblierungen allein über die Plasmid-Sequenzläufe nicht aufgelöst wer-

den. Um zunächst die Anzahl der rRNA-Operons im Genom zu bestimmen, wurden un-

spezifische Primer innerhalb der 23S rRNA a/jointfilesconvert/333809/bgeleitet und rekombinative PCRs mit al-

len verbliebenen offenen Contig-Enden durchgeführt. In einer zweiten Runde rekombi-

nativer PCRs wurden danach die Enden aller identifizierten rRNA-Cluster miteinander

kombiniert. Diese Amplifikationen über die gesamten RNA-Operons hinweg wurden

mit Hilfe von

TripleMaster-PCRs durchgeführt, die speziell für die Amplifikation lan-

ger DNA-Fragmente entwickelt wurden (siehe 2.7.1). PCR-Produkte wurden als Tem-

plates für schrittweise Primerwalkings durch die gesamten rRNA-Operons genutzt.

3.I.1.4 Strukturierung des Gesamtdatensatzes

Nach der Vereinigung aller editierten Contigs in einem Gesamtdatensatz wurde nach

Möglichkeiten gesucht, die Übersichtlichkeit des Datensatzes durch weitergehende

Strukturierung zu erhöhen.

1. Zunächst sollten diejenigen Contigs aussortiert werden, deren Sequenz das Mega-

plasmid pHG1 abbildete. Dazu wurden aus Textdateien künstliche Sequenzläufe herge-

stellt und daraus im Gesamtdatensatz ein Contig mit der bekannten Sequenz des Mega-

plasmides assembliert. Über

Find Internal Joins wurden alle Contigs des Datensatzes

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