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MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2

rekombinantes Plasmid mit Insert tragen, von denjenigen unterschieden werden, die nur

den leeren Vektor enthielten.

Das Enzym β-Galactosidase spaltet neben dem eigentlichen Substrat Lactose auch 5-

Brom-4-Chlor-Indoyl-µ-D-Galactosid (X-Gal). Dabei entsteht der Farbstoff 5-Brom-4-

Chlor-Indigo, der sich in Anwesenheit von Sauerstoff spontan blau verfärbt (Horwitz et

al., 1964). Im X-Gal-Test werden E. coli-Stämme eingesetzt, die durch eine Deletion im

Chromosom eine inaktive β-Galactosidase ohne N-Terminus bilden. Geeignete Vekto-

ren sind in der Lage, diesen Effekt zu kompensieren. Sie tragen neben dem Promotor-

und Operatorbereich des lac-Operons auch das 5'- Ende des lacZ-Gens, welches für das

sogenannte α-Peptid kodiert. Dies kann in vivo mit der verkürzten β-Galaktosidase zum

aktiven Enzym assoziieren (α-Komplementation). Da die multiple Klonierungsstelle des

Vektors innerhalb des lacZ-Gens liegt, wird die Bildung des α-Peptids verhindert, wenn

der Vektor ein Insert trägt. Auf Indikatorplatten, die IPTG (zur Induktion der β-

Galactosidase) und X-Gal enthalten, können blaue Kolonien, die nur den Plasmid-

Vektor enthalten von weiße Kolonien, die mit hoher Wahrscheinlichkeit ein Plasmid

mit Insert tragen, unterschieden werden.

2.7 Amplifikationen

2.7.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ermöglicht die hocheffiziente in vitro-

Amplifikation spezifischer DNA-Bereiche. Sie wurde verwendet, um gezielt einzelne

Bereiche des Genoms zu amplifizieren, um Assemblierungen im Datensatz zu überprü-

fen und um Sequenzlücken, die von der Genbank nicht erfaßt wurden, zu überbrücken.

Die Amplifikationsreaktion wurde mit zwei unterschiedlichen Ansätzen durchgeführt.

Für die Amplifikation kurzer DNA-Bereiche (0.5-5.0 kbp), wie sie zur Erhöhung der

Sequenzabdeckung durchgeführt wurde, kam eine Taq-Polymerase (Fa. Eppendorf,

Hamburg) zum Einsatz (siehe Standard-Ansatz). Längere Amplifikationen (4-8 kbp),

z.B. über größere Sequenzlücken hinweg, wurden mit dem TripleMaster long range -

Ansatz des TripleMaster

PCR-Systems durchgeführt. Als Template diente genomi-

sche DNA bzw. Plasmid- und Cosmid-DNA. Die verwendeten Primer wurden in Länge

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