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MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2

Nach dem Ende der Rohsequenzierungsphase des Genomprojekts wurden alle Sequenz-

läufe (readings), die sich aus dem Ansequenzieren von Plasmid- und Cosmid-Inserts

(templates) ergaben, computergestützt assembliert (Gcphrap). Readings wurden zu

Contigs assembliert, kontinuierlichen Sequenzabschnitten, die aus vielen miteinander

überlappenden Sequenzbereichen bestehen. Contigs wurden zu Supercontigs geordnet,

die weitreichende Genombereiche überspannen, aber noch Sequenzlücken zwischen den

Contigs enthalten (Gap4).

2.11 Lückenschluß

Um Überlappungen zwischen zwei Contigs zu identifizieren, diese Contigs miteinander

zu verbinden und damit eine Sequenzlücke zu schließen, wurde entweder die Funktion

Find Internal Joins aus dem Programm Gap4 verwendet oder ein Vergleich mittels

BLAST-Algorithmus (Altschul et al., 1990) durchgeführt, der sich in der Praxis als

empfindlicher und zuverlässiger erwies (siehe 2.12).

2.11.1 Primerwalking

Beim Primerwalking handelt es sich um die einfachste und schnellste Methode zum

Lückenschluß direkt nach der Rohsequenzierungsphase. Bei einer durchschnittlichen

Insertgröße von 2-3 kbp in den Plasmid-Genbanken der Genomprojekte (siehe 2.8.1)

kann mit der Ansequenzierung der Inserts von beiden Seiten nicht die komplette Se-

quenz des Templates erfaßt werden. Beim sogenannten Primerwalking wird diese Lücke

durch Sequenzierung mit geeigneten Primern auf den Templates geschlossen. In der

Contig-Darstellung (Template Display) von Gap4 werden zusammengehörende Se-

quenzläufe eines Templates markiert und als Plasmidbrücken dargestellt, wenn sie mit

verschiedenen Contigs assembliert sind (Abb. 3.4). Sequenzlücken, die von sogenann-

ten Plasmidbrücken überspannt werden, können über die Sequenz des Templates er-

schlossen werden.

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