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INHALTSVERZEICHNIS

2.6 Transformation und Selektion .......................................................................... 17

2.6.1 TOPO TA-Klonierung ............................................................................... 17

2.6.1.1 Ligation mit dem TOPO - Vektor....................................................... 18

2.6.1.2 Transformation von E. coli TOP10 - Zellen....................................... 18

2.6.2 Blau-Weiß screening (X-Gal-Test) ........................................................... 18

2.7 Amplifikationen................................................................................................ 19

2.7.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ............................................................ 19

2.7.2 GenomiPhi-Amplifikation ......................................................................... 22

2.8 Genbanken ........................................................................................................ 23

2.8.1 Plasmidbanken........................................................................................... 23

2.9 Sequenzierung................................................................................................... 24

2.9.1 Sequenzierung mit dem ABI PRISM

377................................................ 24

2.9.2 Sequenzierung mit MegaBACE 1000 bzw. MegaBACE 4000 ................. 26

2.10 Prozessierung und Assemblierung der DNA-Sequenzen ............................... 28

2.11 Lückenschluß.................................................................................................. 28

2.11.1 Primerwalking.......................................................................................... 29

2.11.2 Lückenschluß mit PCR ............................................................................ 29

2.11.2.1 Ableitung über Cosmidbrücken........................................................ 29

2.11.2.2 Ableitung über konservierte Genabfolgen (peptide links)................ 30

2.11.3 Multiplex-PCR......................................................................................... 30

2.12 BLAST............................................................................................................ 31

2.12.1 Bidirektionaler BLAST............................................................................ 32

2.13 Vorhersage und Annotation kodierender Sequenzen...................................... 33

2.13.1 Vorhersage kodierender offener Leserahmen (CDSs)............................. 33

2.13.2 Vorhersage von Transfer-RNAs (tRNAs) ............................................... 34

2.13.3 Annotation in ERGO ............................................................................... 34

2.13.4 Kontrolle der CDS-Längen...................................................................... 35

2.14 Kumulativer GC-Skew.................................................................................... 35

2.15 Untersuchungen zur Codon Usage (SIGI)...................................................... 36

3 Ergebnisse.................................................................................................................... 37

3.I Das Ralstonia eutropha H16-Genomprojekt......................................................... 37

3.I.1 Sequenzierung ................................................................................................ 37

3.I.1.1 Strategie................................................................................................... 37

3.I.1.2 Rohsequenzierungsphase......................................................................... 37

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