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MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2

TOPO-Vektor besitzt in entsprechender Weise einen Thymidin-Überhang, der durch ei-

ne spezielle Topoisomerase erzeugt wird, die bis zur Ligation mit dem Insert kovalent

gebunden bleibt. Auf diese Weise wird einerseits die Ligation mehrerer Inserts mitein-

ander verhindert als auch der enzymatische Verdau des Vektors erschwert (Shuman,

1991).

2.6.1.1 Ligation mit dem TOPO - Vektor

Der folgende Ansatz wurde 2 h bei RT inkubiert und danach zur Transformation che-

misch kompetenter E. coli TOP10 -Zellen verwendet (2.6.1.2):

4 µl Ansatz

Insert DNA mit A-Überhang

Salt Solution (TOPO-Kit, Fa. Invitrogen)

PCR TOPO-Vektor (Fa. Invitrogen)

3 µl

0.5 µl

2.6.1.2 Transformation von E. coli TOP10 - Zellen

Der gesamt Reaktionsansatz der TOPO-Ligation (siehe 2.6.1.1) wurde für die Trans-

formation eingesetzt. Dazu wurden die 4 µl Reaktionsansatz zu 70 µl E. coli TOP10-

Zellen gegeben und der Ansatz zuerst 10 min auf Eis und anschließend 45 s bei 42 °C

inkubiert. Danach wurden die Zellen sofort auf Eis gestellt und mit 400 µl LB-Medium

vermischt. Die transformierten Zellen wurden anschließend für 1.5 h bei 37° C und 180

rpm geschüttelt. Die Selektion erfolgte auf LB-Platten mit Ampicillin, die über Nacht

bei 37 °C inkubiert wurden.

2.6.2 Blau-Weiß screening (X-Gal-Test)

Das Blau-Weiß screening diente neben der Antibiotikaresistenz der schnellen Selektion

erfolgreich transformierter Klone. Anhand der Färbung konnten solche Klone, die ein

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