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MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2

wurde das ERGO Programmpaket verwendet (Overbeek et al., 2003). Unter der Funk-

tion contig regions können mit ERGO die Umgebungen ausgewählter, homologer Gene

in verschiedenen Organismen verglichen werden, um konservierte Gen-Cluster zu iden-

tifizieren (Abb. 3.11). Zwischen nah verwandten Organismen besteht häufig eine Kon-

servierung der Genabfolge, die sich nicht nur über funktionelle Operons sondern über

große Teile des gesamten Genoms erstreckt. Aus der Zuordnung der Gene eines Contig-

Endes zu einem konservierten Cluster in einem verwandten Organismus kann dement-

sprechend auf Gene desselben Clusters geschlossen werden, die am Ende eines benach-

barten Contigs zu erwarten sind.

2.11.3 Multiplex-PCR

Nach der Bearbeitung aller Informationen aus Plasmid- und Cosmidbrücken und kon-

servierten Genabfolgen bietet sich für die Verknüpfung der restlichen Contig-Enden die

Multiplex-PCR an (Tettelin et al., 1999). Deren Prinzip beruht auf der Bildung von Mi-

schungen unterschiedlicher Primer (pools), die in verschiedenen PCR-Reaktionen mit-

einander kombiniert werden. Dazu wurden an allen Contig-Enden längere Primer a/jointfilesconvert/333809/bge-

leitet (ca. 22 nt) und zu pools aus jeweils fünf Primern vereinigt. In mehreren PCR-

Runden wurden zunächst Kombinationen verschiedener pools identifiziert, mit deren

Hilfe erfolgreiche Amplifikationen durchgeführt werden konnten und anschließend ein-

zelne Primer dieser pools über Standard-PCRs miteinander kombiniert. Multiplex-PCRs

wurden im folgendem Ansatz nach dem PCR-Programm für TripleMaster-PCRs (long

range) durchgeführt:

Multiplex-PCR-Ansatz

Primer-pool 1 (je 1 : 10)

Primer-pool 2 (je 1 : 10)

Tuning Buffer

dNTPs

TripleMaster-Polymerase

DNA

bidest

2 µl

1 µl

0.16 µl

120 ng

ad 20 µl

1 2 ... 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 ... 185 186

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