MTD 243-670 Manual do Utilizador descarregar pdf (Página 33)

4 Material und Methoden

gebracht. Davon wurden jeweils 3 µl in vier verschiedene Reaktionsgefäße

aliquotiert, zu denen je 1 µl der Sequenzierreagenz des entsprechenden Dideoxy-

Nukleotids gegeben wurde. Anschließend wurde der Reaktionsansatz mit 20 µl

Mineralöl überschichtet und die Amplifikation in beschriebener Weise einer PCR

durchgeführt. Danach erfolgte das Stoppen der Reaktion mit 3 µl des im Kit

enthaltenen formamidhaltigen Auftragspuffers. Die Abbruchprodukte der Reaktion

wurden mittels eines Sequenzierer (Li-COR II 4000S, MWG Biotech AG Ebersberg)

in einem denaturierenden 6 % Acrylamidgel (SequaGel XR, Biozym Diagnostik,

Hess. Oldendorf) aufgetrennt. Die während des Laufs anfallenden Daten wurden

gesammelt und anschließend ausgewertet.

4.9.11 Primer Extension

Der Transkriptionsstartpunkt von Genen wurde nach Ausubel et al. (1996) mit

folgenden Modifikationen bestimmt: Es wurden 20 µg Gesamt-RNA aus M. voltae in

exponentieller Wachstumsphase, 3 pmol eines mit IRD-800 markierten

Oligonukleotids, (MWG Biotech AG Ebersberg), 2 µl 10 mM dNTPs (je 2,5 mM) in

12 µl H

O für 10 min bei 70°C inkubiert und anschließend auf 42°C langsam

a/jointfilesconvert/481994/bgekühlt. Dem Ansatz wurden 10 mM DTT, 200 U SuperScript

II RNase H

Reverse Transcriptase (Invitrogen

life technologies, Karlsruhe) nach Angaben des

Herstellers zugegeben. RNaseOut

(Invitrogen

life technologies, Karlsruhe) wurde

durch 40 U RNase Block Ribonuclease Inhibitor (Stratagene, Amsterdam,

Niederlande) ersetzt. Das Gemisch wurde in einem Endvolumen von 20 µl

Reaktionspuffer für 30 min bei 42°C inkubiert und nach Zugabe von 180 µl 10 mM

Tris/HCl, pH 8,0, 1mM EDTA mit Phenol/Chloroform extrahiert. Die wässrige Phase

wurde zu einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml mit Glycogen und von 0,3 M mit Na-

Acetat, pH 5,6 versetzt. Nach dem Mischen des Ansatzes wurden 0,8 V Isopropanol

hinzugefügt und die gefällten Nukleinsäuren für 30 min bei 13 000 x g und 4°C

sedimentiert. Der Niederschlag wurde mit 80 % Ethanol gewaschen, bei

Raumtemperatur getrocknet und in 3 µl H

O und 2 µl formamidhaltigem

Auftragspuffer (DYEnamic Direct Cycle Sequencing Kit, Amersham Biosciences,

Freiburg) aufgenommen. Vor der Analyse wurde die Probe für 5 min bei 70°C

inkubiert und anschließend neben einer Sequenzreaktion, die mit dem gleichen

Oligonukleotid durchgeführt worden war, in einem denaturierenden 6 % Acrylamidgel

1 2 ... 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 ... 100 101

Sem comentários

MTD 243-670 Manual do Utilizador Página 33